ПЦР-диагностика: что это такое и как работает метод полимеразной цепной реакции

История создания метода

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году американский учёный Кэри Мюллис. Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является одним из самых точных и чувствительных методов выявления инфекционных заболеваний.

Что такое ПЦР?

Полимеразная цепная реакция — это экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий значительно увеличить малые концентрации определённых фрагментов ДНК в биологическом материале (пробе).

В основе метода лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатывается количество ДНК, достаточное для визуальной детекции. При этом копируется только тот участок, который присутствует в исследуемом образце и удовлетворяет заданным условиям.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом: введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК, клонирование генов, выделение новых генов.

Специфичность и применение метода

ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом». Он проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

Преимущества ПЦР-диагностики

• позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей без трудоёмких микробиологических методов;
• чувствительность метода значительно превосходит иммунохимические и микробиологические методы;
• специфичность ПЦР достигает 100% для вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций;
• позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов;
• обнаруживает возбудителей в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен ПЦР для диагностики:

• трудно культивируемых и некультивируемых форм микроорганизмов;
• скрыто существующих форм микроорганизмов (при латентных и хронических инфекциях);
• возбудителей с высокой антигенной изменчивостью;
• внутриклеточных паразитов.

Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале от больного, но и в объектах внешней среды (вода, почва и др.).

Области применения ПЦР-диагностики

В урологии и гинекологии

• хламидиоз;
• уреаплазмоз;
• гонорея;
• герпес;
• гарднереллёз;
• микоплазменная инфекция;
• ВПЧ (вирусы папилломы человека).

В пульмонологии

• дифференциальная диагностика вирусных и бактериальных пневмоний;
• туберкулёз.

В гастроэнтерологии

• выявление хеликобактериоза (Helicobacter pylori).

В клинике инфекционных заболеваний

• экспресс-диагностика сальмонеллёза;
• дифтерия;
• вирусные гепатиты В, С и G.

В гематологии

• выявление цитомегаловирусной инфекции;
• онковирусы.

Диагностика вирусных инфекций

• гепатиты;
• ВИЧ;
• коронавирус COVID-19 (мазок из носа и зева на определение РНК вируса SARS-CoV-2).

Как работает ПЦР: принцип метода

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами — короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18–30 букв. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг) последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Компоненты для проведения ПЦР

• ДНК-матрица — содержит участок ДНК, который требуется амплифицировать;
• два праймера — комплементарные концам требуемого фрагмента;
• термостабильная ДНК-полимераза;
• дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
• ионы Mg²⁺ — необходимы для работы полимеразы;
• буферный раствор.

Оборудование

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок (с точностью не менее 0,1°C). Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло (например, вазелиновое). Добавление специфических ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Ход реакции (циклы ПЦР)

Обычно выполняется 20–35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий:

1. Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94–96°C (или до 98°C для особо термостабильных полимераз) на 0,5–2 минуты. Цепи ДНК расходятся (разрушаются водородные связи). Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев в течение 2–5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

2. Отжиг

Температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига обычно выбирается на 4–5°C ниже температуры плавления праймеров. Время стадии — 0,5–2 минуты.

3. Элонгация (удлинение цепи)

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Температура элонгации зависит от полимеразы (часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C). Время элонгации — примерно одна минута на каждую тысячу пар оснований.

Финальная элонгация

После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации (10–15 минут), чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты.

Подготовка материала к исследованию и транспортировка в лабораторию

Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки.

Для взятия крови в лабораториях в настоящее время применяются вакуумные системы, которые:

• минимально травмируют пациента;
• позволяют взять материал без контакта с персоналом и окружающей средой;
• избегают контаминации (загрязнения) материала;
• обеспечивают объективность ПЦР-анализа.